8 Minutės
Tyrėjai sukūrė aukštos spartos audinių užšaldymo metodą, kuris fiksuoja smegenų ląsteles veikimo metu, atverdami naują langą į sinapsių procesus, vykstančius dalelėmis sekundės dalimis. Technika, vadinama „zap-and-freeze“, leidžia mokslininkams tirti, kaip neuronai supakuoja, išskiria ir atkuria smulkias vezikules, pernešančias chemines žinutes — tai turi potencialios reikšmės neurodegeneracinėms ligoms, tokioms kaip Parkinsono liga.
Signalo užšaldymas milisekundėmis
Pagrindinė idėja yra paprasta, bet techniškai sudėtinga: elektriškai stimuliuoti neuronus, o po kelių milisekundžių audinį užšaldyti didelio slėgio sąlygomis, taip sustabdant dinaminius įvykius ir leidžiant juos vėliau ištirti elektroniniu mikroskopu. Taikant šį metodą tiek žmogaus smegenų mėginiams, paimtiems per neurochirurgines operacijas, tiek pelių audiniams, išsaugoma ląstelių architektūra ir tuo pačiu užfiksuojami trumpalaikiai sinapsinių perdavimo žingsniai.
Tyrėjai vaizdavo ląstelių veiklą milisekundėmis po stimuliacijos
Sinapsės bendrauja per neurochemines vezikules, užpildytas neurotransmiteriais, kurios susilieja su presinapsine membrana ir išskiria savo krovinį; po to vezikulės turi būti perdirbtos ir atkurti, kad neuronas galėtų toliau perduoti signalus. Daugelis to ciklo etapų vyksta per greitai, kad juos būtų galima aiškiai fiksuoti įprastinėmis šviesos arba įprastinio fiksavimo metodikomis. Zap-and-freeze technologija užpildo šią spragą — ji suteikia momentines membranos transporto ir vezikulių dinamikos „nuotraukas“ subsekundiniais laiko tarpsniais, leidžiančias analizuoti mechanizmus, kurie anksčiau buvo tik prielaidomis arba netiesioginiais rodikliais.
Tokia užšaldymo strategija yra ypač vertinga, kai reikia atskirti greituosius mechanizmus, pvz., sinaptinę egzocitozę, momentinį membranos persitvarkymą ar ultragreitą endocitozę, nuo lėtesnių procesų, kuriuos galima aptikti ilgalaikio fiksavimo ar gyvų vaizdavimo metu. Be to, derinant šiuos vaizdus su kvantitaciniais funkciniais duomenimis (pvz., elektrofiziologija ar optogenetika), galima susieti struktūrinius pokyčius su greitai kintančia veikla — tai padidina supratimą apie sinapsių fiziologiją ir patologiją.
Ką komanda atrado
Pritaikius „zap-and-freeze“ metodo protokolus tiek pelių smegenų pjūviams, tiek žmogaus pacientų audiniams, mokslininkai aptiko įrodymų apie itin greitą endocitozę — vezikulių surinkimą, kuris užbaigiamas per mažiau nei 100 milisekundžių po stimuliacijos. Tai rodo, kad egzistuoja labai spartus vezikulių perdirbimo kelias, leidžiantis sinapsei praktiškai „įkrauti“ vezikules ir tęsti intensyvų signalų perdavimą be ilgo atsipalaidavimo. Šis greitojo perdirbimo būdas, atrodo, yra išsaugotas tarp rūšių, o tai sustiprina argumentą, kad pelės modeliai yra tinkami žmonių sinapsijų biologijos tyrimams.
Molekuliniame lygmenyje tyrėjai identifikavo tam tikrą svarbios GTPazės izoformą — dinamino varianto dynamin1xA — kaip esminį elementą šiam ultragreitam endocitozės keliui. Dynamin baltymai padeda „užkimšti“ membranos kvadratą, užrišti ir atskirti plazminę membraną, kad susidarytų naujos vezikulės; nauji duomenys rodo, jog specifinės izoformos arba alternatyvūs splicing variantai gali leisti šiam procesui vykti žaibišku greičiu aktyviose sinapsėse. Tokie molekuliniai atradimai suteikia konkrečius taikinius tolimesniems genetikos ir farmacologijos tyrimams.
Komanda taip pat pastebėjo laiko ir erdvės skirtumus tarp skirtingų sinapsių tipų: tam tikros sinapsės, ypač intensyviai dirbančios terminaluose, rodė stipresnį ultragražų endocitozės žymėjimą, o kitos, rečiau aktyvios sinapsės, įjungdavo labiau tradicinius perdirbimo kelius. Tai reiškia, kad neuronų tinklų funkcijos ir aktyvumo režimai gali sąlygoti, kokius molekulinius mechanizmus sinapsė naudoja vezikulių atstatymui.
Kodėl tai svarbu ligų tyrimams
Neteisingas sinaptinis perdavimas ir sutrikęs vezikulių perdirbimas yra susiję su įvairiomis neurodegeneracinėmis ligomis, įskaitant Parkinsono ligą, kuriai būdingas progresuojantis neuronų nykimas ir signalizacijos disfunkcija. Vaizduodami sinaptinės membranos dinamiką tiesiogiai žmogaus audinyje, mokslininkai gali palyginti sveiką veiklą su ligos pažeistų smegenų modeliais ir ieškoti ankstyvųjų trikdžių vezikulių transportavimo cikle. Tokie palyginimai gali padėti identifikuoti patologinius žingsnius, atsirandančius prieš prasidedant neuronų mirtims ar plėtojantis simptomams.
Johns Hopkins ląstelių biologas Shigeki Watanabe, vadovavęs studijai, pabrėžia, kad tarp pelės ir žmogaus audinio išsaugotas mechanizmas stiprina transliacijos tyrimų svarbą: supratimas, kaip sinapsės „sugenda" modeliniuose organizmuose, gali atskleisti terapinius taikinius, svarbius žmonėms. Be to, molekuliniai žymenys, pvz., dynamin1xA alternatyvūs izoformų profiliai, gali tapti diagnostiniais arba prognostiniais rodikliais, padedančiais identifikuoti pacientus, kuriems kiekvienos rūšies sinaptiniai mechanizmai yra pažeisti.
Konkrečiai Parkinsono ligos kontekste, sutrikimai vezikulių sugrįžimo ar membranos rekonstrukcijos etapuose gali sukelti lėtą, bet nuolatinį sinapsinės funkcijos praradimą, o tai ilgainiui lemia motorinius ir net motorikos-negaliaujančius simptomus. Stebint ultragražius perdirbimo sutrikimus žmogaus audinyje, tyrėjai gali nustatyti, ar šie defektai yra ankstyva patologijos dalis ar vėlesnė pasekmė, ir pasirinkti tinkamiausią laiką intervencijoms.
Metodai, mėginiai ir etiniai svarstymai
Metodika reikalauja greito priėjimo prie šviežio audinio ir glaudaus bendradarbiavimo su chirurgų komandomis. Aprašytuose eksperimentuose mėginiai buvo paimti iš pacientų, kuriems atliekama smegenų operacija dėl pažeidimų ar navikų; prieš tyrimus gautas sutikimas ir atlikti reikalingi etiniai leidimai. Būsimi tyrimai sieks įtraukti ir audinius, paaukotus pacientų su Parkinsono liga, kurie dėl klinikinių priežasčių patiria invazines procedūras — su tinkamais leidimais tai suteiktų galimybę tiesiogiai įvertinti ligai būdingus sinapsinius pokyčius.
Be praktinio iššūkio gauti žmogaus audinį, zap-and-freeze procedūra priklauso nuo itin tikslaus laiko suderinimo tarp stimuliacijos ir kriofiksacijos, specializuotos aukšto slėgio užšaldymo įrangos ir vėlesnių elektroninės mikroskopijos etapų, kurie leidžia membranos morfologiją analizuoti nanometro skalėje. Kiekvienas žingsnis reikalauja optimizacijos: nuo elektrostimuliacijos parametrų (amplitudės, dažnio, impulsų trukmės) iki užšaldymo slėgio ir laiko tarpo, per kurį užšaldymas turi būti inicijuotas, kad būtų fiksuoti konkretūs tarpiniai etapai.
Eksperimentų reproducibility užtikrinimui svarbu standartiškai aprašyti visus veiksmus ir kontrolinius eksperimentus: pavyzdžiui, palyginti su neveikiančia stimiliacija, įvairiomis temperatūros pradinėmis sąlygomis, arba genetiškai modifikuotais modeliais, kuriuose trūksta tam tikrų endocitozės baltymų. Techniniai kontroliniai variantai taip pat apima fermentų inhibitorius ar temp-toxin testus, leidžiančius patvirtinti, kad pastebėtos struktūrinės permainos yra funkcinių procesų rezultatas, o ne artefaktai, susiję su užšaldymo procedūra ar mėginio apdorojimu.
Pasekmės ir tolesni žingsniai
Trumpuoju laikotarpiu zap-and-freeze suteikia naują instrumentą bazinėms sinapsių fiziologijos studijoms — leidžia identifikuoti baltymus ir etapus vezikulių perdirbime, kurie veikia ypač greitais laiko intervalais. Tai suteikia galimybę sukurti molekulinius žemėlapius, apibūdinančius, kurie komponentai įsijungia per pirmąsias kelias dešimtis ar šimtus milisekundžių po stimuliacijos, ir kaip jų veikla koreliuoja su funkciniais rodikliais.
Ilgalaikėje perspektyvoje, žemėlapiuoti, kaip ultragreitas endocitozė kinta Parkinsono ligos ar kitų smegenų sutrikimų atveju, gali atskleisti intervencijos taškus, kuriuos būtų galima taikyti, siekiant sulėtinti arba užkirsti kelią sinapsinių funkcijų praradimui. Pavyzdžiui, jei paaiškėtų, kad specifinė dynamino izoforma yra sumažinta arba disfunkcinė pacientų audiniuose, tai suteiktų pagrindą vystyti tikslines terapijas, nukreiptas atkurti arba kompensuoti tą veiklą.
Komplementariniai metodai — gyvojo audinio superrezoliucinis vaizdavimas, optogenetinė stimuliacija, genetiniai ir molekuliniai perturbacijų modeliai — gali būti derinami su zap-and-freeze, kad būtų susieti funkcionalūs matavimai su aukštos raiškos struktūrinėmis momentinėmis nuotraukomis. Multimodalinė strategija pagerins mechanistinį supratimą, padidins rezultatų validumą ir leis geriau atrinkti potencialius vaistų taikinius. Be to, integruojant kvantitacinius duomenis iš elektroninės mikroskopijos su proteomika ar transkriptomika, galima identifikuoti papildomus reguliatorius ir tarpininkus, dalyvaujančius ultragreituose perdirbimo procesuose.
Tolimesniuose tyrimuose verta įtraukti plačiau diferencijuotus pacientų mėginius, apimančius skirtingus Parkinsono ligos etapus bei kitas neurodegeneracines būkles, kad būtų galima nustatyti bendrus ir specifinius sinapsinių mechanizmų pokyčius. Taip pat naudinga optimizuoti metodiką, kad ji taptų labiau prieinama įvairiems laboratoriniams centrams, įskaitant mažesnius universitetinius institutus, siekiant pagreitinti atradimus ir jų patikrinimą nepriklausomose grupėse.
Ekspertų įžvalgos
„Sinapsių fiksavimas veikimo metu yra didelis žingsnis į priekį,“ sako dr. Laura Chen, neurofiziologė, nebuvo susijusi su tyrimu. „Tokios metodikos kaip zap-and-freeze suteikia platesnį vaizdą apie tai, kaip neuronai palaiko greitą signalizaciją. Esant ligoms, tokioms kaip Parkinsono, tikslus supratimas, kurie žingsniai nutrūksta, gali būti raktas į racionalias terapijas, pagrįstas mechanizmu, o ne bandymais ir klaidomis.“
Nors atradimų perkėlimas į gydymus užtruks, žmogaus audinio duomenų derinys su tarpų rūšių išsaugotais mechanizmais ir naujomis molekulinėmis vadovėmis, pvz., dynamin1xA, suteikia perspektyvią kryptį sinapsėms skirtų tyrimų programai neurodegeneracijos srityje. Toks kelių disciplinų bendradarbiavimas — jungiant, pavyzdžiui, neurochirurgiją, elektroninę mikroskopiją, molekulinę biologiją ir farmakologiją — greičiausiai pagreitins tikslinių intervencijų identifikavimą ir įvertinimą.
Galutinė technikos vertė priklausys nuo jos pritaikomumo klinikiniams tyrimams ir nuo to, ar galima nustatyti patikimus biomarkerius arba vaistinius taikinius, kurie atkuria arba apsaugo greitąją sinapsinę perdirbimą. Jeigu ultragreitas endocitozės kelias bus tiesiogiai susietas su ankstyvais Parkinsono ligos pokyčiais, tai atvers naujas diagnostikos ir gydymo galimybes, kurių iki šiol nebuvo įmanoma aiškiai nustatyti tradiciniais metodais.
Šaltinis: sciencealert
Palikite komentarą