5 Minutės
Įsivaizduokite stovint prie mažo dirbtuvių slenksčio, kur molekuliniai mechanizmai kliūčioja, persitvarko ir reaguoja. Jų negalima paliesti. Jų negalima pažymėti. Tačiau veiksmas vyksta čia ir dabar. Tai nauja pažada iš Stanfordo komandos, kuri sujungė dvi vaizdinimo tradicijas, kad atskleistų gyvas ląsteles su tokio lygio detalumu, kuris anksčiau nebuvo pasiekiamas be fluorescencinių žymų.
Ląstelių matymas be žymų
Kelerius dešimtmečius fluorescencinė mikroskopija buvo ląstelių biologijos darbo arklys. Pažymėkite baltymą, stebėkite, kaip jis juda. Toks požiūris turi aiškų kompromisą. Žymos suteikia specifiškumą, bet jos riboja, ką vienu metu galite matyti ir kiek ilgai galite stebėti. Fluorescenciniai dažai blunka. Genetinės žymos gali pakeisti elgseną. O kas, jeigu būtų galima stebėti daug struktūrų vienu metu, nieko nepridėjus prie ląstelės?
Ateina Interferometrinė vaizdo skenavimo mikroskopija, arba iISM. Technika fiksuoja natūralią ląstelių komponentų sklaidą ir sustiprina tą silpną šviesą interferometrijos ir multi-elementinio detektoriaus pagalba. Rezultatas – bežymių vaizdas su maždaug 120 nanometrų raiška, skalėje, kurioje matomos membranos subdomenai, maži organelės ir didesni baltymų kompleksai jų natūralioje aplinkoje. Tokio aiškumo lygis anksčiau reikalavo fluorescencijos arba labai specializuotos aparatūros.
W.E. Moerner, Nobelio premijos laureatas už darbą superrezoliucinėse fluorescencinėse metodikose, ir postdoktorei Michelle Kueppers vadovavo šiam tyrimui. Jie savo darbą pristato žurnale Light: Science and Applications. Teiginys nėra triumfalistinis. iISM yra papildoma priemonė. Ji nesiekia pakeisti fluorescencijos. Vietoj to ji siūlo kitus pranašumus: kontekstą, ilgesnį stebėjimo laiką ir švelnesnį apšvietimą.
Michelle Kueppers ir W.E. Moerner.
Kaip iISM sujungia dvi tradicijas
Esmėje iISM derina interferometrinę sklaidos mikroskopiją su pritaikyta vaizdo skenavimo forma, naudojančia kamerų masyvus. Abi sudedamosios dalys yra gerai žinomos, bet kartu jos sukuria ką nors naujo.
Interferometrinė sklaida remiasi paprasta fizine tiesa. Kai šviesa susiduria su mažu objektu, dalis jos išsisklaido. Ta išsisklaidžiusi šviesa neša informaciją apie objektą, bet dažnai yra labai silpna. Interferometrija sustiprina matomą signalą maišydama išsisklaidžiusią bangą su referencine spinduliuote, paversdama mažus fazės ir amplitudės skirtumus į aptinkamus kintamuosius. Tai panašu į radijo imtuvus, kurie derina signalus, kad pagerintų priėmimą.
Įprastiniai konfokaliniai mikroskopai sprendžia erdvinį neryškumą atmesdami užfokusuotą šviesą per mažą angą ir fiksuodami fotonus vienu detektoriumi. Modernūs vaizdo skenavimo metodai tą vieną detektorių pakeičia pikselių masyvu. Kiekvienas pikselis fiksuoja šiek tiek kitokį to paties mažo tūrio vaizdą. Turint daug perspektyvų, galima kompiuteriniu būdu atkurti aštresnį vaizdą. Galvokite apie tai kaip apie dešimtis ar šimtus akių, stebinčių tą pačią sceną, o ne tik dvi akis.
Stanfordo komanda įdiegė masyvinį detektorių, kuris surenka daugiau šviesos nei smulki anga, ir sukūrė procesą, leidžiantį sujungti tas kelias perspektyvas. Rezultatas – bežymių vaizdas su pagerintu kontrastu ir ašine tikslumu. Svarbiausia, iISM tai pasiekia naudodama mažesnę apšvietimo galią, palyginti su kitais aukšto kontrasto bežymių metodais. Mažesnė galia reiškia mažiau fotopavojingumo ir ilgesnius gyvų ląstelių stebėjimo langus.
Tokia kombinacija atveria galimybes stebėti dinamiką, kurią sunku sekti naudojant fluorescenciją. Tyrėjai gali vienu metu sekti kelias nepažymėtas struktūras ir stebėti jų reakcijas į impulsus, pavyzdžiui, patogenus ar vaistus. Kadangi žymos nėra įvedamos, struktūros matomos jų natūralioje būsenoje, suteikiant kontekstą gyvų ląstelių vaizdinimui be žymėjimo.
Panaudojimas, bendradarbiavimas ir artimiausios perspektyvos
iISM iš karto patraukia dėmesį dėl savo plataus pritaikymo galimybių. Moerner ir Kueppers jau naudoja instrumentą bendruose projektuose per Stanfordą. Viena komanda realiu laiku stebi sąveikas tarp augalų ląstelių, grybų ir bakterijų. Kita tiria vėžio vaisto įėjimo kelią į ląsteles. Trečia planuoja fiksuoti, kaip raudonosios kraujo ląstelės deformuojasi sergant maliarija. Tai praktiškos, didelės svarbos problemos, kuriose bežymių kontekstas yra svarbus.
Už šių pradinių projektų ribų technika gali paveikti kelias gyvybės mokslų sritis. Patogenų įėjimo, membranų pertvarkymo, intraceliulinio transporto ir vaistų įsisavinimo tyrimai visi gali gauti naudą. Pavyzdžiui, vaistų kūrime iISM gali atskleisti, kaip kandidatinė molekulė keliauja per ląstelių barjerus be fluorescencinių žymų trikdžių. Augalų biologijoje ji gali parodyti daugiacelių sąveikas prie šeimininko ir mikrobų sąsajos.
Yra kompromisų. iISM dar neprilygsta molekuliniam specifiškumui, kurį suteikia taikoma fluorescencija. Ji negali vienaidentiškai atpažinti vieno baltymo iš tūkstančių. Tačiau Kueppers ir Moerner numato hibridinę ateitį, kur fluorescencija suteiktų molekulinę tapatybę, o iISM – bežymių kontekstą ir dinaminį diapazoną. Kartu šie vaizdai suteiktų tyrėjams tiek kas, tiek kaip.
Ekspertų įžvalga
"Tai pragmatiškas žingsnis į priekį," sako dr. Elena Park, ląstelių vaizdinimo specialistė viename tyrimų institute, nesusijusiame su šiuo darbu. "Svarbu ne tik raiška, bet ir galimybė stebėti procesus jų nepakitusioje būsenoje. iISM sumažina stebėtojo poveikį. Tai gali pakeisti eksperimentų dizainą ir atverti klausimus, kurių anksčiau negalėjome formuluoti."
Dr. Park priduria atsargumo žodį. "Įsisavinimas priklausys nuo naudojimo paprastumo ir prieinamumo. Jei technologija taps prieinama daugiau laboratorijų, atradimai pagreitės. Jei liks retenybe, pažanga bus lėtesnė."
Moerner ir Kueppers, atrodo, sprendžia šią kliūtį. Jie tobulina instrumentą ir siekia bendradarbiavimų, demonstruojančių metodą įvairiose biologinėse sistemose. Toks sklaidos darbas svarbus, kad technologija persikeltų iš vienos laboratorijos į bendruomeninį įrankį.
Praktinės naudos yra aiškios. Mažesnis fototoksiškumas, išplėstas gyvo vaizdinimo laikas, kelių nepažymėtų struktūrų vienalaikis vizualizavimas ir suderinamumas su greita dinamika suteikia naudingą įrankių rinkinį daugeliui eksperimentų. Už klausimų, kuriems reikalingas molekulinis specifiškumas, fluorescencija lieka nepakeičiama. Už klausimų, kuriems reikalingas kontekstas ir švelnus stebėjimas, iISM yra perspektyvi.
Trumpai tariant, iISM prideda naują, pragmatišką objektyvą mikroskopijos įrankių rinkiniui. Ji pirmenybę teikia subtilumui, o ne šou. Ji atskleidžia judesį in situ, nepadengdama ląstelės fluorescenciniais dažais. Mokslininkams, norintiems stebėti gyvenimą veikiančiu formatu, o ne jį žymėti, tai yra didelis žingsnis į priekį.
Šaltinis: scitechdaily
Palikite komentarą